2019-nCov-M Pseudovirus Standard Reference

2019-nCov作为一种新型冠状病毒，是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，该病毒采集自不同地区患者的病毒样本相关序列也已发布至2019新型冠状病毒信息库（https://bigd.big.ac.cn/ncov）。NCBI收录序列为NC_045512.2，全长29903bp，基因编码4个结构蛋白：S，M，N和E。

为了满足临床诊断的需要，截止目前，国家已经紧急批准了几款核酸诊断试剂盒上市，用于临床诊断，其中多数都是采用RT-PCR的方法，多日的临床检测结果显示，该诊断存在高比例的假阴性问题，往往需要多次的检测，才能被最终验证，同时科技部也是应急征集除普通实时定量荧光PCR外快速诊断产品，理论上ddPCR、NGS、三代测序都能更好的检测病毒，同时监控病毒的变异。

不管是哪一类产品，试剂盒的检测限问题，是造成假阴性的最大根源，因此针对诊断产品的检测限，我们需要认真做每款试剂盒的性能评价。以往针对检测限的性能评价，一般是选择体外转录的RNA、或者临床阳性病毒来作为标准品，用于性能评价。但是两者都具有很明显的确定，首先体外转录的RNA，一般是很纯，单一，不涉及提取，不符合临床病毒的微环境，因此必然造成检测灵敏度被高估，这也是存在高概率假阴性的主要原因；再次临床阳性病毒，即使是灭活的病毒，也是存在很大的生物安全隐患，因此要求实验室级别为P3-P4，大部分开发诊断试剂盒单位都不满足改要求，另外临床阳性病毒也是来源很有限，不能被稳定供应，反复用于试剂盒的性能评价。

有病毒的完整包膜结构，有2019-nCov对应的核酸序列，但是生物安全风险较低的假病毒标准品，完美的克服了选择体外转录的RNA、或者临床阳性病毒来作为标准品的缺点，非常适合用于核酸诊断新型冠状病毒2019-nCov。

构建过程：2019-nCov基因合成→假病毒包装→纯化→QC检测（ddPCR）

Gene M（669bp）

• 根据新型冠状病毒的特点，选取了ORF1ab/RdRP（RNA-dependent RNA polymerase）、Gene E(envelope protein)、Gene N(nucleocapsid phosphoprotein)、Gene S、Gene M 5个区段的序列，用于假病毒的包装，5个区段很好的表征了2019-nCov的特征序列；

• 科佰生物设计了ddPCR体系的引物、探针序列，可不需要构建标准曲线的前提下完成对假病毒的QC拷贝数检测，非常准确表征标准品的拷贝数，而且克服了Q-PCR分析CT值的相对判断标准的不准确性；

• 假病毒标准品，无致病性，可再生，质控方法可靠，批次间稳定，可以长期稳定制备和供应，而且要求实验室生物安全级别为P2，满足很多单位的安全需求。

Gene M:

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