细胞RNAi技术

▏ RNAi技术服务

近年来的研究表明，将与mRNA同源的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA（dsRNA）导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，从而抑制其相应基因的表达。这种转录后基因沉默机制（Post-transcriptional gene silencing, PTGS）被称为RNA干扰（RNAi）。由于RNAi具有高度的序列专一性，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此RNAi可以作为一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。

科佰生物应用国外知名公司的RNAi Designer平台，可对靶基因序列进行干扰位置效应评价和序列同源型分析，完成siRNA/miRNA多种序列的的设计，并提供从siRNA合成、RNAi载体构建到RNAi功能验证等全面的RNAi解决方案。

▏ siRNA合成服务

对于瞬时基因沉默实验，化学合成siRNA的方法操作简便，容易获得高水平的瞬时沉默效果，特异性强。我们通过严格设计来增强siRNA的专一性；针对某靶基因设计的3条siRNA可保证其中两条的Knockdown效率达到75％（在转染效率大于80％的情况下）。

在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA 3’端12个碱基的位置切割mRNA。

▏ siRNA合成实验流程

1）根据序列信息，进行化学合成；
2）纯化及定量；
3）冻干处理；
4）细胞转染预实验，优化转染条件；
5）瞬时转染或稳定转染；
6）RT-PCR或Western blot检测转染后某一时间点靶基因的RNA水平或蛋白水平的变化。

▏ 质量保证

针对某靶基因设计的3条siRNA可保证其中2条的Knockdown效率达到75％（在转染效率大于80％的情况下）。

▏ shRNA构建服务

构建shRNA表达载体，实现shRNA在细胞中稳定表达，能够弥补瞬时转染持续时间短的不足。

▏ shRNA构建实验流程

1）mRNA序列分析；
2）引物设计及合成；
3）单链互补引物退火；
4）将片段克隆至载体；
5）测序以确保插入序列正确性；
6）细胞转染预实验，优化转染条件；
7）瞬时转染或稳定转染；
8）RT-PCR或Western blot检测转染后某一时间点靶基因的RNA水平或蛋白水平的变化。

▏ 质量保证

针对某靶基因设计的3条shRNA序列，在转染效率>80％的前提下，我们保证至少有1个克隆可以达到70％转录水平的沉默效率。

▏ miRNA构建服务

RNAi载体利用细胞内源性的miRNA加工机制，相比传统shRNA载体可更高效地表达RNA发夹结构，并具有采用GFP进行表达追踪的优点。每个基因设计的4条序列我们保证至少有2条可以达到至少70％转录水平的Knockdown效率（在转染效率大于80％的情况下）。

▏ miRNA构建实验流程

1）针对特定基因，设计miR RNAi序列，合成该序列并退火生成双链DNA；
2）将DNA与载体连接并转化；
3）测序验证miRNA序列的正确性；
4）细胞转染预实验，优化转染条件；
5）瞬时转染或稳定转染；
6）RT-PCR或Western blot检测转染后某一时间点靶基因的RNA水平或蛋白水平的变化。

▏ 质量保证

针对某靶基因设计的3条miRNA序列，在转染效率>80％的前提下，我们保证至少有1个克隆可以达到70％转录水平的沉默效率。

▏ 客户提供

1）目的基因的Accession Number（Human、Mouse或Rat种属）以及技术要求（包括OD和nmols的精确数量、纯化类型和修饰要求等）；

2）细胞株和详细的细胞培养的操作步骤；

3）一抗（如果需要Western blot检测）。

 

▏ 服务说明

1. RNAi技术服务不包括基因功能检测，如需检测，需要另外评估和收费；
2. 客户可以提供实验原材料，也可以查找本公司模板库、载体库、细胞库，也可以由我们公司代购；