慢病毒包装

▏ 服务原理

慢病毒载体(Lentiviral vector, LVs)是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效的将目的基因(或RNAi)导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒载体基因组是正链RNA，其基因组进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白;或产生RNAi干扰。

慢病毒载体介导的基因表达或RNAi干扰作用持续且稳定，原因是目的基因整合到宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂。另外，慢病毒载体能有效感染并整合到非分裂细胞中。以上特性使慢病毒载体与其它病毒载体相比，比如不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统逆转录病毒载体，有鲜明的特色。大量文献研究表明，慢病毒载体介导的目的基因长期表达的组织或细胞包括脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等。

慢病毒载体不表达任何HIV-1蛋白，免疫原性低，在注射部位无细胞免疫反应，体液免疫反应也较低，不影响病毒载体的第2次注射。

▏ 服务简介

慢病毒( Lentivirus)属于逆转录病毒科(Retroviridae)，为RNA病毒，如人免疫缺陷病毒(HIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、牛免疫缺陷病毒等。由于对HIV-1的研究最广泛最深入，对其生物学特性最为了解，因此HIV-1来源的慢病毒载体已成为其中的代表。



HIV-1为双链RNA病毒，共有9个基因，如图1所示。gag、pol、env3个基因编码病毒的基本结构，tat、rev为调节基因，vif、vpr、vpu、nef 4个为辅助基因。其中，gag基因编码病毒的核心蛋白，包括基质蛋白、衣壳蛋白、核衣壳蛋白;pol基因编码病毒复制所需的酶，如反转录酶、整合酶、蛋白酶，env基因编码病毒的包膜糖蛋白，决定病毒感染宿主的靶向性。rev编码的蛋白调节gag、pol、env的表达水平，tat编码的蛋白参与RNA转录的控制。4个辅助基因编码的蛋白则作为毒力因子参与宿主细胞的识别和感染。两端为长末端重复序列(LTR)，内含复制所需的顺式作用元件，如包装信号元件Ψ。

第一代慢病毒载体系统是以三质粒系统为代表，该系统由包装质粒、包膜质粒及载体质粒3种质粒组成。包装质粒是HIV-1前病毒基因组5’端LTR由巨细胞病毒早期启动子取代，3’LTR由SV40 polyA序列取代。包装成分分别构建在两个质粒上，一个表达gag和pol，另一个表达env。载体质粒携带了5’端LTR，和全部5’端非翻译区域，另外还带有rev应答元件(RRE)。包膜表达质粒使用水疱性口炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)用来代替了原病毒的env基因。

第二代慢病毒载体系统是在第一代的基础上进行改进，在包装质粒中删除了HIV的所有辅助基因(vif、vpr、vpu和nef基因)。这些附属基因的去除并不影响病毒的滴度和感染能力，同时增加了载体的安全性。

第三代慢病毒载体系统由四质粒代替原有的三质粒包装系统。将rev基因单独放在一个包装质粒上。同时又增加了两个安全特性：一是构建自身失活的慢病毒载体，即删除了U3区的3′LTR，使载体失去HIV-1增强子及启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA;二是去除了tat基因，用异源启动子序列代替，这样原始的HIV-1基因组中的9个慢病毒载体中只保留了3个(gag、pol和rev)。因此第三代慢病毒载体系统更加安全。

▏ 服务优势

能将外源基因有效整合入宿主染色体，外源基因表达水平较高、表达稳定;
广泛的宿主，可感染分裂和不分裂的细胞，几乎可以感染所有类型的细胞，特别适合质粒载体转染效率低的细胞;
适用范围广，可用于体外细胞系和活体动物模型，研究基因和RNAi等;
转导效率高，不需要转染试剂，目的基因整合到宿主细胞基因组的概率大大增加。

科佰生物拥有丰富的病毒包装经验，成功为很多客户包装出需要的病毒，并且完成相应的功能检测

▏ 服务流程

1）获得目的基因序列;
2）构建慢病毒载体;
3）重组质粒和包装质粒共转，包装病毒;
4）病毒纯化、浓缩;
5）滴度测定。
6）对照组和实验组感染细胞，利用抗生素筛选，得到稳定单克隆细胞株(可选)。

▏ 案例展示

▏ 服务说明

1）客户提供目的基因的序列，如果提供模板，请告知载体、酶切稳点等信息;
2）若实验材料为原代细胞或者特殊培养的细胞，请先咨询;
3）公司默认提供病毒滴度为1x107-1x108TU/ml,规格1ml;
4）目的蛋白的功能验证另外收费。