dPCR检测
▏ 服务原理
研究PCR技术从1983年开始依次经历普通PCR，Real-Time PCR和dPCR，现如今dPCR技术的发展就像1990年代末的Real-Time PCR发展一样，发展迅猛。
下面我们以DdPCR为例，讨论dPCR技术。
什么是DdPCR? 有什么技术特征？有哪些方面的应用？
DdPCR全称Droplet Digital PCR，引用bio-rad的描述为Droplet Digital PCR technology is a digital PCR method utilizing a water-oil emulsion droplet system. Droplets are formed in a water-oil emulsion to form the partitions that separate the template DNA molecules. The droplets serve essentially the same function as individual test tubes or wells in a plate in which the PCR reaction takes place, albeit in a much smaller format. The massive sample partitioning is a key aspect of the ddPCR technique.
从基本原理我们不难看出，DdPCR最大的优点是绝对定量，表现为：
· 绝对定量 -ddPCR技术无需输入标准曲线即可提供每个输入样品的目标DNA拷贝的绝对计数,使该技术非常适合目标DNA的测量，病毒载量分析和微生物定量；
· 较高的精确度 – ddPCR提供的大量样品分配功能可以可靠地测量样品中靶DNA序列拷贝数的微小差异；
· 提高信噪比 -稀释高拷贝模板和背景，有效富集靶标阳性分区中的模板浓度，从而可以灵敏地检测稀有靶标，并实现±10％的定量精度，灵敏度可达单个核酸分子，检测限低至0.001%；
· 消除PCR偏差 -消除qPCR的扩增效率依赖性，降低了错误率，可检测到小的（1.2倍）差异，这里需要指出的是；
· 降低了耗材成本 -反应体积在皮升至纳升的范围内，减少了试剂的使用和每个数据点所需的样品量，对于珍贵的样品尤其适用；
· 降低设备成本 -基于乳液的反应系统意味着PCR反应可以在标准的热循环仪中进行，而无需复杂的芯片或微流体。
· 出色的分区 -ddPCR技术每20 µl样品可产生20,000个液滴，在96孔板上可进行近200万个分区PCR反应，分区数量越多，精度越高。
▏ 服务应用
DdPCR技术有很多方面的应用，我们按照发表文章的领域，可以简单划分为：
结合肿瘤领域，我们一般与之相关的有4个领域的应用：
1. 检测Gene Expression，主要是检测mRNA的定量分析；
2. 检测Mutation（SNV和Indel），可以检测拷贝数，也可以检测比率；
3. 检测CNV（拷贝数变异分析），相对定量；
4. 检测Fusion，可以检测拷贝数，也可以检测比率；
▏ 案例展示
科佰生物针对以上应用开发对应的检测试剂盒，配套科佰生物的参考品，对试剂盒做性能评价，如下我们以EGFR T790M为例：
实验一：LOB空白限测试
待测样本：20个阴性样本和1个NTC。分别将投入量设置为10ng和40ng，每个样本做两个重复进行Bio-Rad数字PCR检测。
由上数据可见：无论是10ng还是40ng，LOB控制在2拷贝以内（一般噪音拷贝为5以内），杂点不呈现剂量的依赖，是随机产生的噪音信号。
实验二：准确性测试
待测样本：10个NGS验证为阳性的样本（编号1-10）; 10个NGS验证为阴性的样本（编号11-20）。对20个样本分别使用数字PCR检测。
由上数据可见：
①测试10个NGS阳性样本,检测结果均为阳性，阳性符合率100%，并定量检出变异频率。
②测试10个NGS阴性样本,检测结果均为阴性，阴性符合率100%，定值变异频率均为0%。
实验三：线性范围测试
1、投入量与拷贝数、频率之间的线性测试
首先选取50%突变频率的EGFR T790M标准品(CBP10402)，该标准品是通过基因编辑，二等位基因，CN=2，编辑一条为mutation，一条为WT，经过理论值计算、Sanger测序、Bio-Rad DdPCR试剂盒（Assay ID: dHsaCP2000019）共同验证，确认为50%的频率。
1.1 投入量在0.1ng~200ng间设置10个梯度，进行数字PCR检测（2复孔），分别考量FAM拷贝数与投入量是否线性相关、VIC拷贝数与投入量是否线性相关；
1.2 投入量在0.1ng~200ng间设置10个梯度，进行数字PCR检测（2复孔），判断是否满足%AF=50±10%波动。
由上数据可见：
①200 ng投入量过大，拷贝数不呈现线性，虽然满足45-55%范围，但是不适合做单一通道的拷贝数判定；
②0.1 ng投入量过小，拷贝数不呈现线性，同时42.59%也低于45%，不适合做单一通道，也不适合做双通道；
因此：范围为0.5-100ng。
2、线性稀释不同频率理论值与检测值的线性测试
根据以上结论，我们选取10ng作为进一步的%AF线性范围探索，首先使用EGFR T790M的对应的阴性标准品，对50%的标准品进行有限稀释，0.1%-50%间设置9个AF梯度，进行数字PCR检测（2复孔）。
由上数据可见：在10ng的投入量下，AF%呈现非常好的线性稀释，存在波动，但是都在误差范围内。
实验四：检测限测试
我们可以通过理论计算来预测下可能的检测限范围。当控制拷贝在15000（对应50ng input）以内时LOB数据是2，2/15000=0.0133%，预测检测限为0.0200%。
在如此低频的情况下，临床适用场景适合ctDNA，一般来说临床上10ml全血，一般中位值ctDNA是20-40ng，取最低值20ng。20ng 理论值6000个拷贝数，2/6000=0.0333%，预测检测限为0.0500%。
0.05%的误差范围是±50%，就是0.025-0.075%，因此我们选择3个点，探寻LOD分别为 0.010%、0.050%、0.100%，要求95%检出。
0.010%
对20个0.01%的样本进行数字PCR检测，观察在0.005-0.015%以内是否达成95%检出。
0.05%
对20个0.05%的样本进行数字PCR检测，观察在0.025-0.075%以内是否达成95%检出。
0.1%
对20个0.1%的样本进行数字PCR检测，观察在0.05-0.15%以内是否达成95%检出。
由上数据可见：选择0.05%作为该检测试剂盒的检测限LOD。
实验五：精密度测试
选取强阳性2%样本20个，中阳性1%样本20个，弱阳性0.2%样本20个分别进行数字PCR检测。
由上数据可见：强阳性2% 、中阳性1% 、弱阳性0.2%三种检测体系下，误差均在合理的范围内，精密度良好。
实验六：回收率测试
首先使用EGFR T790M的对应的阴性标准品，对50%的标准品进行有限稀释，每个梯度使用阴性样本两倍稀释，接着对11个样本进行检测。
由上数据可见：当AF在0.05%-50%范围内，对应的回收率在80-120%范围，符合预期。
实验七：重复性测试
取10个不同AF（1%~50%）的标准品样本，分别安排实验员A、实验员B在同一天，每人进行四次检测。
由上数据可见：EGFR T790M检测体系是稳定可重复的检出的。
实验八：重现性测试
取10个不同AF（1%~50%）的标准品样本，分别安排①实验员A、实验员B在同一天进行每人四次实验测试；②实验员A在第一天、第二天分别进行四次实验测试；③实验员A在第一天进行四次实验测试，实验员B在第二天进行四次实验测试。
由上数据可见：EGFR T790M检测体系是稳定可重复的在不同人、不同时间检出，重现的。
科佰生物已经开发了多款dPCR试剂盒检测体系，并利用自身的标准品进行了性能验证。可用于基因突变，融合，拷贝数变异等的检测。同时，我们可以提供dPCR检测的科研服务，基于其绝对定值、精准定量的强大优势，为客户的样本检测提供优质服务。
